描述/主要部件：

在很多领域，尖端科学的进步依赖于单分子研究。例如，包括在材料和生命科学中，分子运动的量化和分子互作的研究。这些应用的特点，进一步对设备仪器的灵活性和多样性提出了要求。MicroTime200——时间分辨共聚焦荧光显微系统，能够满足这样的多功能性。这样一款功能强大的设备可用于荧光寿命成像（FLIM）、FLIM/FRET、厚组织FLIM、PIE、FCS/FCCS、双聚焦FCS、扫描FCS、各向异性、单脉冲荧光分析、AFM/FLIM联用或深紫外激发-探测等方法，分析低至单分子尺度下的多种参数。通过新的MIcroTime200 STED附件，甚至可以实现低至50nm的高分辨率成像

灵活的激发单元

MicroTime200的激发光子系统包含PDL系列的激光器驱动源和不同皮秒脉冲激光器（连续出光模式可选）。可用波长范围从375nm至900nm。

激光器的出光功率和重复频率可由PDL系列的激光驱动器灵活调整。多通道激光驱动器PDL828“Sepia II”支持几个激光器同时激发和脉冲交替激发（PIE）的技术。

所有的激光头都集成在一个激光耦合单元（LCU）中，最后统一耦合进入光纤，大大提高了激光器操作的灵活性、激光衰减调节和耦合的便利性。MicroTime200系统还提供一个额外的激发光耦合输入口，可以用来兼容其它的激发光源，譬如用于双光子激发的钛蓝宝石激光器。采用我们独有的双光子激发单元附件，外部飞秒激光器的输出可以轻松的耦合进入MicroTime200的主光路中。

扫描单元

MicroTime200可以配备多种扫描装置。振镜扫描可以用于快速采集图像，压电平台设备在可用波长上有最大的灵活性。FLIMbee振镜能够提供从非常慢到非常快的不同扫描速度，同时保持较高的空间精度。高灵活速度的扫描可以用于rapidFLIM技术，来实现从磷光寿命成像（PLIM）到快速荧光寿命测量的应用。此外，由于其高精度和高灵敏度，FLIMbee振镜适用于STED进行超分辨显微成像，从而使成像分辨率提升至单分子水平。

配备了FLIMbee振镜的MicroTime200是单光子检测（SMD）的理想选择，如：spFRET、PIE-FRET、(STED-)FCS、FLCS、FLCCS、双聚焦FCS (2fFCS)，甚至各向异性的测试。此外，还可以进行共聚焦和NDD检测的双光子激发（TPE）。

FLIMbee振镜的核心是由三个高精度转向镜组成，它们具有出色的线性度、重复性和低漂移。两个Y轴振镜保证激光光束固定在物镜入口。这个镜子结构最大程度减小了像场的渐晕，确保在较宽的扫描范围内保持恒定的聚焦体积。使用100x物镜时，FLIMbee振镜可提供低至10nm的最小像素尺寸。

对于待测发光波长在紫外（255~400nm）和近红外的（1100~1400nm）光谱范围，或像素尺寸要求小于10nm的应用，推荐使用压电平移台。

单光子灵敏度的探测单元

MicroTime200系统专为单分子研究而设计，里面所有的光学器件都大大的减少了光的吸收。在这个共聚焦显微镜系统中，扫描通过压电平台轻松解决，也可以通过升级高精度的PiFoc配件完成高精度的3D成像。压电平台的扫描方式，保证了较高的重复定位精度和稳定性，而这些正是单分子研究至关重要的。

MicroTime200系统最多可以配置多达六路独立的检测通道。每个探测通道可以选择不同的单分子级别检测器， 比如根据荧光波长、信号亮度和荧光寿命挑选不同的探测器，从而获得理想探测方案。检测器的种类包含PMA Hybrid系列，高效率的SPAD以及用于深紫外的专用PMT探测器。

皮秒分辨率的计数单元

时间分辨显微镜不仅需要记录光子本身，还需要他们在时间上的位置，而对于成像应用，还需要空间信息。 PicoQuant公司研发的时间标记时间分辨Time-Tagged Time-Resolved（TTTR）数据的收集可以完美的实现这些要求。该方法基于经典的时间相关单光子计数（TCSPC）方法。TTTR数据采集模式的优点在于，仅仅基于一种数据格式，只是通过执行各种不同的测量程序，就可以实现譬如FLIM，FCS甚至符合相关（“反聚束”）等应用。PicoQuant所有的TCSPC电子设备都支持该TTTR数据格式。使用这些高端的集成器件，低至几个皮秒的荧光寿命或者高达毫秒的磷光寿命，以及发光研究都可以轻松解决。

直观的数据处理和分析软件

基于尖端的数据采集和处理方式，系统软件SymPhoTime 64支持多种分析方法，譬如强度随时间轨迹分析、突发分析、寿命柱状图、荧光相关光谱（FCS）、荧光寿命相关光谱（FLCS）、荧光寿命成像（FLIM）、荧光共振能量转移（FRET）和各向异性等。SymPhoTime 64采用一个透明的数据结构，所有数据都存放在一个工作区中,包括来跟踪所有测量的一个日志文件和分析步骤。

SymPhoTime64提供了强大的灵活性、新颖的整合能力、以及尖端的算法。专用脚本语言接口允许用户修改和扩大分析程序。除了SymPhoTime64软件内的数据分析外，数据还可以以标准格式导出，用于外部分析。

我们的互动用户论坛以及我们定期举办的SymPhoTime workshop，可以给新老用户提供出色的持续支持。

科学指导和用户培训

PicoQuant每年举办《时间分辨显微和相关光谱》欧洲短期课程。本课程面向希望深入了解时间分辨荧光显微镜原理及其应用在生命科学中的个人用户。这项为期3天的活动包括讲座、仪器仪表和软件实践培训。有关详细信息，请参阅课程网站（https://www.picoquant.com/events/details/microscopy-course）。

PicoQuant还主办了一个论坛（http://forum.picoquant.com/），作为公司系统、组件和软件包用户的知识交流平台。

MicroTime 200是具有单分子灵敏度的时间分辨共聚焦显微镜。 因此，该仪器可以实现许多应用，包括：

• 单分子光谱/检测
• 时间分辨荧光
• 荧光寿命成像（FLIM）
• 磷光寿命成像（PLIM）
• 荧光相关光谱（FCS）
• 荧光寿命相关光谱（FLCS）
• 荧光共振能量转移（FRET）
• 双聚焦荧光相关光谱（2fFCS）
• 扫描FCS （sFCS）
• 脉冲交替激发（PIE）
• 荧光各向异性（偏振）
• 模式匹配分析
• 时间分辨光致发光（TRPL）
• TRPL 成像
• 反聚束效应

Add-on options选项：

基于受激发射损耗STED的超分辨成像

MicroTime 200 STED选项通过受激发射损耗（STED）的原理来达到低于50nm的空间分辨率。STED显微系统中包含两束光源，其中一束为激发光，另外一束为Donut形状的损耗光。在MicroTime 200 STED系统中，Donut由一个叫做EASYDOnut的相偏板产生。MicroTime 200 STED系统无需冗长的对准准备工作，已经成为一套耐用性强，且易于操作的超分辨系统，同时保留Microtime 200系统的所有的功能，以及对系统后续升级的可能性。

与光镊结合使用

PicoQuant和Ionovation联合开发，将时间分辨显微镜和光镊结合在一个系统中。两种仪器都保留其各自的功能，而且还可以一起使用，从而使客户能够对诸如细胞等被捕获物体进行时间分辨荧光显微分析（例如荧光寿命成像）。

Ionovation的PicoTweezers系统是一款紧凑有力的光镊设备，并配备实时视频检测。与普通光镊系统相比，PicoTweezers没有空间限制，并且与所有样品载体兼容。该系统非常适用于分子相互作用研究、力学、细胞捕获、流式学和许多其他应用。

原子力显微镜AFM结合使用

原子力显微镜和单分子灵敏度的共聚焦荧光显微镜MicroTime200相结合，使结构学、动力学和单分子研究有机的结合在一起。原子力显微镜揭示了纳米级分辨率的大分子复合物的结构，而荧光有助于组成部分的识别。此外，由于原子力显微镜针尖的纳米光子效应，如荧光猝灭或增强，可进一步增加光学分辨率，乃至超出衍射的级别。该技术的进展使得人们首次实现了对生物样品高精度物理接触作用研究，乃其参数的测量。

所述的MicroTime200目前已经兼容三种不同的原子力显微镜：

BioScope Catalyst: Bruker

NanoWizard 4: JPK

MFP-3D-BIO: Asylum research

紫外升级套件

MicroTime200紫外升级套件允许直接检测天然发色团组织的内源性生物分子荧光，如酪氨酸或色氨酸。紫外升级套件使用266nm激光器、紫外敏感的光电倍增管探测器和石英光学部件。对于荧光寿命检测和荧光寿命成像都可以轻松升级。而且可见光谱的荧光检测不受影响。

双焦点FCS（2fFCS）

在2fFCS中，两个偏振垂直的半导体激光器以脉冲交替激发（PIE）的方法产生一个稳定的双焦点几何形状。这个稳定的双焦点距离为研究溶液扩散学提供了固定长度的范围，克服了单焦点FCS的各种不稳定性和局限性。因为单焦点FCS的分析依赖于共焦体积的大小和形状的知识。这使得2fFCS大幅度的提高了测量绝对扩散系统的精度。

单分子灵敏光谱仪选项

通过增加具有单分子灵敏CCD的光谱仪（Andor公司的SR-163）为MicroTime200对单分子的研究打开了一个新的前景。光谱仪通过一根多模光纤连接到MicroTime200主光单元的一个出口上。在主光路单元内部，具有一些合适的光学元件用来将一部分发射光引导到该出口。该光学元件（100%反射镜，50/50分束器，…）可以根据用户的实验要求进行简单的更换。根据获知实验要求，一部分荧光用来获得光谱信息。单分子的强度波动，荧光衰减特性和光谱数据可以同时获得。光谱随时间的变化以及不同分子的光谱比较都可以通过MicroTime200对光谱仪的结合而成为可能。

双光子激发单元

Examples示例

rapid FLIM高速荧光寿命成像系统

单层囊泡大小不一，从巨型（GUVs）到大型（LUVs）甚至到小型（SUVs）。它们是研究例如膜中微结构域的形成或蛋白质的组织的强大模型。囊泡膜组成的灵活性允许引入特殊标记的脂质，从而增加了它们在使用高灵敏寿命检测技术的生物物理研究中的重要性。囊泡膜内发生的快速过程及其高迁移率都需要非常快速的寿命成像，以防止信息丢失。借助FLIMbee振镜组件和rapidFLIM的方法，每秒可以获取多个FLIM图像，从而可以准确地观察和分析单层囊泡及其膜中发生的过程。上面显示的一系列巨型单层囊泡（GUVs）的FLIM揭示了有关囊泡运动和嵌入膜中的染料的荧光寿命的信息。囊泡膜含染料罗丹明和NBD。由于染料在表面上的染料比例不是恒定的，因此可以观察到荧光寿命的轻微变化。以每秒6张图像的帧速率获取图像序列。

样品详细信息：

具有NBD和罗丹明标记的脂质的GUVs（无相分离）：DOPC + 0.5 mol % Palmitoyl-C6-NBD-PC + 0.5 mol % N-Rhd-DOPE

NBD标记的Palmitoyl-C6-NBD-PC（磷脂酰胆碱）

罗丹明标记的N-Rhd-DOPE（二油基磷脂酰乙醇胺）

实验配置：

• MicroTime 200
• 振镜：FLIMbee
• TCSPC 单元：TimeHarp 260 NANO
• 激发光：LDH-D-C-485，485 nm、40 MHz
• 长通滤光片： 488 nm
• 75 x 75 µm，300 x 300像素， 1 µs/像素
• 300帧，每秒5.6帧
• 数据分析：SymPhoTime 64

GUV由柏林洪堡大学分子生物物理实验室的Ivan Haralampiev制备

单分子成像

单分子荧光的检测在生物化学、药物开发和基础研究中具有重要意义。单分子灵敏度的系统旨在最小化光学元件的数量以最大化光通量，这就是为什么通常使用压电扫描系统的原因。借助FLIMbee附件，MicroTime200保留了其出色的单分子灵敏度，并且现在有更高的扫描速度。此例中所示图是在盖玻片上的单个ATTO 655分子获得的，在STED和共聚焦的条件下成像，并获得偏振和时间分辨数据。通过使用脉冲交替激发（PIE），可以同时获取STED和共聚焦数据，使单分子闪烁和漂白的分析变得简单明了。

实验配置：

• MicroTime 200
• 振镜：FLIMbee
• TCSPC 单元：TimeHarp 260 PICO
• 激发光：LDH-D-C-640，640 nm
• 数据分析：SymPhoTime 64

昆虫器官氯离子浓度的监测

利用荧光团寿命对局部环境依赖性的示例

蟑螂腺体是研究上皮细胞离子转运一套有效的模型系统。美洲大蠊的唾液腺着色上对Cl-敏感的荧光染料MQAE。校准之后，Cl- 的浓度变化可被确定为不同刺激下的响应时间变化，这里的「不同刺激」等同于所述唾液腺嵌入的缓冲液不同浓度。方法为：通过记录生理环境的Cl-浓度和人为减少Cl-浓度下的两幅FLIM图像，可以得出Cl-浓度与所测得的荧光寿命的对应关系，即得出Cl-浓度在唾液腺中变化。两个FLIM的图像显示在生理（左）和低（右）氯离子浓度下唾液腺中的荧光寿命。储唾囊显示氯化物浓度显著的变化（蓝→红）。在周围的唾液腺的寿命差是很不明显（绿色）。这也可以在右图的荧光寿命分布直方图中看出。两个FLIM图像显示在生理氯离子浓度（左）和低氯离子浓度（右）下的唾液腺中的荧光寿命。唾液囊显示氯离子浓度的显著变化（由蓝到红）。在周围的唾液腺的寿命差很不明显（绿色）。这也可以在荧光寿命分布直方图中看出。

实验配置：

激发波长 780 nm (TPE)，SpectraPhysics MaiTai

探测波长：420 nm -460 nm

分析： SymPhoTime 64

由波茨坦大学的Carsten Dosche的Carsten Hille提供

单光子线的多级FRET分析

采用时间相关单光子计数（TCSPC）来检测光子线的多级FRET。为了产生光子线，用五种染料对DNA染色，分别是RHG、TMR、ATTO590、LCR和ATTO680，每种光谱间隔大概3.4nm。固定化的多发色团分子被470nm激发，因此逐步进行单向的FRET。在四个光谱分离的通道中探测到了发射光（图B-C）。这些光子可以很容易地归给四个光谱不同的亚群，从而能够逐步计算FRET效率。比如，在图A中被标记4的光子线，是经历到最后一个步骤的Atto680 FRET样品，但对于每个FRET步骤也都有发射。相比之下，第二个光子线（图A中标记了1的）显示的FRET只到第二种染料。在光谱拆分后，可用宏观时间观察时间强度涨落（看相对荧光强度）。

由于涉及到的染料的具有非平凡发射模式（每种染料的光谱都有交叉），仅仅从基于荧光强度的信息很难确定发光染料的实际数量。然而，在一级近似下，每一个染料都有一个主要的荧光寿命。因此，过将微观的时间即TCSPC直方图的变化（图中的荧光衰减）也考虑进来， 就可以从荧光寿命衰减中提取所涉及的发射体的数量。通过这种方法，同时获取荧光强度和寿命数据，能够解释在多发色团系统中复杂的FRET机制。尤其是，可以研究非荧光弛豫途径，因为荧光寿命将其视为辐射通道的淬灭。

实验配置：

激发波长：470 nm

发射波长：四通道探测 (500 – 740 nm)

分析软件：SymPhoTime 64

与比勒费尔德大学M. Heilemann、P. Tinnefeld、M.Sauer合作

基于单通道探测器的准多通道FCS

即使只有一个激光波长和一个探测器，FLCS仍能用作“准多通道探测”方案。可以将其理解为针对多色FCS的寿命测量，且有几个固定的优点。它分离自相关曲线（ACF）不是靠区分光谱，而是基于荧光寿命特性。由于FLCS获取了所有光子信号，因此可以定量地分离不同的信号组分（例如发射体）。只要它们的荧光寿命足够不同，就可以分离足够多的几个分量。

由于基于荧光寿命拆分分析，即使两种化合物具有相同的扩散时间，也可以获得不同的ACF。FLCS同样适用于荧光光谱完全重叠的发射体。可以使用标准FCS模型的常规拟合来继续进行分析。

一旦强度分量被分离，即使做互相关也很简单。注意信号包含的多种分量是由一个探测器记录的，因此分别计算的ACF对应于同一探测体积，可以解释为是两个（或更多）完全重叠的激发/探测体积。

如下作为原理验证实验，可以从单个检测器测量中获取Atto655和Cy5的50:50混合物的各个的自相关曲线。 总共四个不同的成分对信号起作用：

1. 来自Cy5的荧光

2. 来自ATT655的荧光

3. 激光的散射

4. 后脉冲，暗计数，室内光噪声

在对照实验中记录了所有四种分量的荧光寿命。图（a）显示了Cy5 和 ATTO-65纯溶液的相关曲线和它们各自的拟合。它们通常使用滤色片分光，用于提取对应光谱下的寿命曲线，从而分别计算混合物的四个分量的FCS曲线（此处仅显示荧光分量）。图（b）显示了Cy5和ATTO-655两种溶液的1：1混合物的相关曲线，以及包含三重态的单组分扩散模型的拟合。注意，尽管该模型是错误的，但它能够再现混合物的相关曲线。图（c）显示Cy5和ATTO-655的1:1混合物的荧光寿命拆分，包含四个寿命信号分量（ATTO-655：红色，Cy5：蓝色，激光散射：绿色，背景光+后脉冲：灰色）的缩放图和荧光寿命曲线（黑色）。归一化模式的比例因子代表了它们各自对测量荧光寿命曲线的贡献（黑线）：48.5％的Cy5、48.5％的ATTO-655、0.8％的散射，2.2％的背景和后脉冲。图（d）显示了这些信号分量的滤波曲线。这四种滤波曲线能够重建（c）的测量直方图。通过使用（d）中所示的滤波曲线，FLCS能分离来自于同一混合物的不同组分的自相关曲线（图f）。除了由于比浓度减半而使相关振幅加倍外，FLCS产生的相关曲线与图（a）中所示的纯溶液几乎相同。

实验设置：

激发波长：640 nm

探测波长：655 nm -725nm

分析软件：SymPhoTime 64

由德国柏林联邦物理技术学院S.Rüttinger提供

参考文献：Rüttinger et al., Journal of Fluorescence, Vol.20, p.0105-0114 (2010)

金刚石中的氮空穴（NV）色心

单纳米大小的类金刚石碳颗粒已在生物物理学、材料科学、纳米医学和光子学领域引起了广泛关注。这与它们特殊的材料特性有关，如化学惰性、生物相容性和硬度，也由于它们特殊的光稳定性。所有的这些应用领域，都希望获得小于10nm的、高亮度且稳定的光致发光颗粒，但在10nm以下的单晶是否能保持稳定发光仍是个问题。演示的FLIM图像证明了稳定性，因为没有发现由于光漂白而导致的单个晶体的失真。反聚束曲线也表明，所研究的纳米晶体中确实只有一个荧光发射体。

实验设置：

激发波长：532 nm

发射波长：600-800 nm

图片尺寸：13 x 13 µm (512 x 512 pixels)

图像：每像素时间：4.00 ms，整个图像：45 min

反聚束点测量：120s

样品由德国斯图加特大学的Fedor Jelezko和JörgWrachtrup提供

参考文献：Tisler J., et.al., Nano, Vol.03, p.1959-1965 (2009)

The following documents are available for download:

• Brochure about the MicroTime 200
• Specifications of the MicroTime 200
• MicroTime 200 - UV Upgrade
• Brochure about the FLIMbee galvo scanner
• Poster: Quick Reference for confocal time-resolved microscopy (FLIM, FRET, FCS)
• Practical Manual for Fluorescence Microscopy Techniques

Presentations (as PDF files)

• UV upgrade for the MicroTime 200
• Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy (FLCS)

Related technical and application notes:

• Technical note: Spectrograph Add-on for the MicroTime 200
• Technical note: Combination of MicroTime 200 with Asylum AFM
• Technical note: Combination of MicroTime 200 with Bruker AFM
• Technical note: Combination of MicroTime 200 with JPK AFM
• Technical note: Sample temperature controller for the MicroTime 200
• Technical note: Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC)
• Technical note: Phosphorescence Lifetime Imaging Microscopy (PLIM) Measurements. Practical Aspects
• Application note: Quantitative Fluorescence Correlation Spectroscopy
• Application note: Time-gated Fluorescence Correlation Spectoscopy
• Application note: Absolute diffusion coefficients
• Application note: Two-Focus Fluorescence Correlation Spectroscopy (2fFCS)
• Application note: Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy (FLCS)
• Application note: Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) in Confocal Microscopy
• Application note: Imaging of molecular distances using FLIM-FRET
• Application note: FRET analysis with Pulsed-Interleaved Excitation (PIE)
• Application note: Two-photon excitation using the MicroTime 200
• Technical note: FLIM: Scanning Speed vs. Excitation Rate