单分子水平的动态结构生物学

许多蛋白质的结构已经使用 X 射线晶体学或冷冻电镜等方法成功解决。 然而，当这些技术遇到本质上无序的蛋白质或不结晶的蛋白质时，问题就显现出来了。 此外，观察蛋白质在其原生环境中执行任务时的动态构象变化需要不同的方法。

在这里，诸如 FRET 和 FCS 等单分子荧光方法开辟了新的可能性，因为它们能够在室温下研究溶液中、甚至细胞中的单个分子，并有可能区分不同位置的亚种群。

smFRET 可以监测附着在不同蛋白质残基上两个或多个荧光标记之间的距离变化，从而提供有关构象变化、折叠或蛋白质相互作用的宝贵信息。 这补充了蛋白质结构模型和分子动力学模拟，使研究人员能够更全面地了解蛋白质的功能。

纳秒时间尺度上的 FCS (nsFCS) 揭示了本质上无序或折叠蛋白质的蛋白质链的重新配置时间。 将这些信息与聚合物物理理论和分子模拟相结合，可以更清楚地了解无序蛋白质动力学。

FCS 在微秒到秒的时间尺度上测量分子扩散行为，和实验环境相关性非常高，可以很好的揭示蛋白质流动性、微环境，或蛋白质寡聚化和相互作用。

相分离驱动的细胞机制

液-液相分离正在成为调节细胞中生物分子空间组织的一种关键机制。 它的基础是通过分子子集的凝聚来进行区域化分隔，从而促进蛋白质相互作用。 由于相分离是一个非常动态的过程，它对环境条件的变化反应非常迅速。

荧光方法可用于研究相分离的动力学，跟踪分子进入不同相的分布，观察不同相的动力学，并探究它们的不同性质:

FCS 可以用于测量标记物种的浓度；它的扩展应用FCCS 和 FLCS 甚至可以同时测量多个物种的浓度。此外，FCS 检测了所研究分子的扩散速度，该扩散速度可能因相而异。

和局部环境粘度或刚度非常相关的分子旋转运动，可以通过荧光各向异性实验来进行观察，从而对FCS进行很好地补充。

被称为荧光传感器的FLIM，可以实时读取pH、温度、膜张力或各种离子浓度等环境参数。 这种额外的信息维度，可以帮助解释不同相的动态，并从物理角度理解它们的特性。

环境传感

蛋白质在细胞内的原生环境的特性，例如分子拥挤、pH 波动或质膜改变，都会影响其功能。 但在许多情况下，并非所有这些参数都是已知的，因此无法在实验中准确复现。

在过去的几年里，已经研发出一系列的荧光传感器，它们可以根据特定的环境变化，来改变它们的荧光寿命，例如温度、钙浓度、葡萄糖浓度或膜张力。通过 FLIM技术，可以以非侵入性方式从活细胞中实时定量读取这些参数，从而为更好地了解蛋白质功能或调节提供背景。

细胞膜动力学和结构的映射

细胞膜是高度复杂和动态的结构。 它们的脂质和膜蛋白的分子组成经过精确调整，从而可以获得其生理功能所必需的物理和化学特性。 可以结合互补的荧光方法从不同的角度对生物膜进行研究：

对带有荧光标记的脂质或膜蛋白进行FCS，可以得到其扩散速度和蛋白质迁移率。它还可以表征在研究分子的浓度，而这些浓度可能因地点而异。

通过各向异性实验，可以获得分子取向及其变化。因此，各向异性成像可以可视化有序和无序的膜相，或监测分子的旋转运动。

荧光寿命成像 (FLIM)

FLIM 是一种荧光寿命成像技术，可以解析和显示单个荧光团的寿命，而不是它们的发射光谱。 荧光寿命定义为分子在通过发射光子返回基态之前保持在激发态的平均时间。 由于荧光寿命与浓度、样品吸收、样品厚度、光漂白和激发强度无关，因此与基于强度的方法相比，FLIM 不易出现伪影。

FLIM 的优势：
. 可用于区分不同的荧光团
. 提供额外的信息维度
. 作为光谱信息的补充
. 成为多种功能成像的首选技术（因为荧光团的寿命会受到环境参数，例如 pH 值、离子或氧浓度或分子结合的影响）

FLIM-FRET – 基于寿命的 Förster 共振能量转移

FRET 是一种非辐射过程，其中来自激发的荧光分子（供体）的能量转移到附近2-10 nm 范围内的非激发荧光团（受体）。 能量转移导致供体猝灭、两个荧光团的荧光强度发生变化，以及供体寿命的缩短。

与测量荧光强度变化的标准 FRET 相比，基于寿命的 FRET 可以通过使用供体分子的荧光寿命作为探针进行定量分析，该荧光寿命与宽范围内的浓度无关。 这是至关重要的，因为在像细胞这样的生物系统中，荧光团浓度通常不能精确地测定，也不能在不同细胞之间进行比较。

FLIM-FRET的优势：基于寿命的FRET可以识别具有不同FRET效率的不同亚群，然而基于强度的FRET只能检测平均值。

smFRET – 单分子 Förster 共振能量转移

在这种类型的实验中，要么在单个分子（包含一个供体和受体）内观察到 FRET 过程，要么在自由扩散通过固定在表面上的共聚焦区域相互作用的分子之间观察到 FRET 过程。

一种对 smFRET 很有帮助的技术是脉冲交错激发 (PIE)，其中几个脉冲激光器是同步的。 激光脉冲在纳秒时间尺度上分离，从而允许同时记录样品分子的时间行为。

在 smFRET 实验中，可以用于交替激发供体和受体。 通过这种方式，受体染料独立于 FRET 过程被激发，以确认其存在和光活性。 缺乏活性供体或受体的分子与活性 FRET 复合体中分离出来。 这使得即使具有非常低 FRET 效率的 FRET 分子，也可以与具有不存在或不发荧光的受体的分子区分开来。

荧光相关光谱 (FCS)

荧光相关光谱 (FCS) 是一种利用荧光强度随时间波动进行相关性分析的荧光光谱技术。 它为引起这些特征波动的光物理学以及检测到粒子的扩散行为和绝对浓度提供了极具价值的参考信息。 FCS 能够测定重要的生化参数，例如颗粒（分子）的浓度、大小或形状或其环境的粘度。

荧光寿命相关光谱 (FLCS)

荧光寿命相关光谱 (FLCS) 是一种利用皮秒时间分辨荧光检测来分离不同 FCS 贡献的方法。
在荧光互相关光谱 (FCCS) 中使用寿命不同、光谱不可分离荧光团时，FLCS 具有特别的优势，因为它可以消除光谱串扰和背景噪声。 它还提供了一种解决探测器后脉冲伪影的方法。

荧光互相关光谱 (FCCS)

荧光互相关光谱 (FCCS) 是根据不同的发射光谱区分来自两种不同物种 FCS 信号的方法。

各向异性成像

稳态荧光各向异性、特别是时间分辨荧光各向异性的测量为研究分子取向和流动性以及影响它们的过程提供了极好的可能性。 一般来说，各向异性不依赖于荧光团的浓度，即与检测到的信号强度无关。这对于解释 smFRET 测量特别重要，其中荧光团迁移率可能会影响共振转移效率。 时间分辨各向异性测量提供更多信息，因为稳态测量仅为时间平均值，而没有直接洞察动态的过程。

自动检测和测量固定发光样品

FRETcompass:
根据 2018 年发表的基准研究，自动确定单分子 FRET 实验中使用的校正因子

InstaFCS:
基于系统建议的模型和参数，进行在线 FCS 拟合

InstaFLIM:
. 为无需用户交互，为FLIM 样品分离提供初步建议
. 系统建议的参数可以进行调整
. 对于 ROI测定，可以提供同步 TCSPC 和相量分析选项

Sample-free auto-alignment:
确保每次测量的最佳性能，即使是最具挑战性的测量

CalEx:
. 激发光源激光功率校准设置和激发强度显示精度可达μW级别
. 无需外部功率计

VarPSF：
在衍射极限和更大的观察视野之间切换