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荧光光谱仪

模块化荧光寿命光谱仪

FluoTime 200

FluoTime 200光谱仪是一款高性能荧光寿命系统,具有模块化结构,单光子灵敏度和研究灵活性等特点。它通过时间相关的单光子计数(TCSPC)和/或多通道测量(MCS)方法记录荧光衰减,该系统包含所需的完整光学和电子设备。该系统针对高时间分辨率进行了优化,可与飞秒或皮秒激光器一起使用,例如PicoQuant 的皮秒激光器。使用FluoTime 200,可以实现几皮秒的时间衰减过程的测量。该系统支持的激光重复频率高达100 MHz,计数速率最高可达几百万个计数/秒。

激光耦合模块



激光耦合模块由虹膜光阑,光束反射镜,可选的可更换偏振器和聚焦透镜组成。光阑可调节控制激发光强度,并防止室内光线进入样品室。该系统还可选是否安装Glan-Thompson棱镜偏振器并选择所需的偏振板。最后,光束通过可调节的反射镜反射后到达样品。


多功能样品室



样品室包含一个多功能的样品架(标准型:单比色皿样品架,可选:正面固体样品架)和一种保护探测器的机械快门机制,该机制可在打开样品室时触发探测器关闭,保护探测器免受过多的光照而损坏。比色皿温度控制可以通过安装外部恒温器(流体通过预安装的管道循环)或通过用帕耳帖控温的支架替换标准的比色皿支架来对比色皿支架进行温度控制。可升级为T型或X型结构。


紧凑型单色仪



为了对发射的光进行光谱选取,系统配置了一个小型单色仪,该单色仪具有较低的时间色散,高通量和较低的杂散光水平。该Seya-Namioka型单色仪的焦距长度为100 mm,孔径为f / 3.2。单色仪标准配置包含一个以1200刻线/ mm的色差校正的32毫米×32毫米凹面全息光栅,闪耀波长在450 nm,光谱(线性)色散为8 nm / mm。该单色仪附带宽度为0.5、1.0和2.0 mm可更换使用的狭缝组,他们分别提供4nm、8nm和16 nm的光谱带宽。可根据要求提供其他光栅。


多种探测器类型可选



多种类型的单光子计数探测器可供FluoTime 200选择,并连接到发射单色仪的狭缝出口。可用的检测器有光电倍增管(PMA系列或NIR-PMT),混合PMT模块(PMA Hybrid系列)或微通道板光电倍增管(MCP-PMT)。这些检测器提供皮秒级的时间分辨率,并覆盖从180 nm至1700 nm之间的不同光谱的范围。每个检测器都包括一个机电快门并可以选择是否配置制冷模块。


TCSPC数据采集



有两款出色的时间相关的单光子计数(TCSPC)数据采集单元可供FluoTime 200选择。TimeHarp 260是配合PMA系列或PMA Hybrid系列探测器系统的理想选择,与其专用的“长寿命模式”一起,TimeHarp 260可用于分辨几十皮秒至几秒范围内的荧光寿命。PicoHarp 300因为其更好的时间分辨率,因而更适合配置了MCP-PMT探测器的FluoTime 200系统,该配置下,选用合适的激发光源甚至可以用于分辨几皮秒的荧光寿命。


强大的数据分析软件EasyTau 2


EasyTau 2具有人性化的全局荧光衰减数据分析操作界面,分析结果简单直观。主要用于分析稳态和时间分辨的数据。EasyTau 2提供基本的数据运算(例如算术,求导,积分或平滑)和拟合功能。衰减拟合模型支持具有非线性误差最小化的尾部和迭代重卷积拟合模型,可以将各种指数衰减模型(最高五阶)或速率常数分布模型用于所测的衰减曲线的拟合,以确定荧光寿命或研究荧光各向异性。bootstrap 方法为拟合结果提供强有力的错误分析能力。


时间分辨荧光课程

PicoQuant每年举办一次“时间分辨荧光光谱原理和应用”欧洲短期课程。本课程面向希望深入了解荧光光谱原理及其在生命科学应用的个人。该课程联合巴尔的摩荧光光谱中心(CFS)的JR Lakowicz教授合作举办,包括讲座、仪器设备和软件动手培训。相关详细信息,请参见课程网站。

光学结构

L型;可根据要求选择T型和X型;

工作模式

时间相关单光子计数(TCSPC)和多通道测量(MCS

荧光寿命范围

50ps10µs,采用PMT探测器和TCSPC模式的计数模块;
< 20 ps
10 µs,采用Hybrid系列探测器和TCSPC计数模块;

< 10 ps10 µs,采用MCP-PMT系列探测器、TCSPC计数模块和合适的激光器;
大于几百ms,采用任何探测器和MCS模式的计数模块。

激发光源

波长范围从250nm~1550nm的皮秒脉冲半导体激光器或者LED系列,重复频率高达80MHz,普通激光器驱动器;

亚毫秒脉冲氙灯;

外部激光源,如钛宝石激光或二极管泵浦的固态脉冲激光

单色仪

Czerny-Turner结构;
聚焦长度: 100 mm,单出口;

光栅:1200g/mm,闪耀波长450nm(可根据需要选择其他光栅);

配备可手动更换的狭缝块;

杂散光抑制比典型值1:10-4

探测器

制冷或非制冷探测器;
光电倍增管PMT系列,185~920nm可选;
微通道光电倍增管MCP-PMT系列,185~910nm可选;
近红外光电倍增管NIR-PMT系列,950~1700nm可选;
混合式光电倍增管Hybrid-PMT系列,300~750nm可选。

软件

操作简单,功能全面;
在工作区数据归档,数据导出功能和数据运算;

荧光寿命光谱分析和基于数卷积处理,高至5阶指数的衰减函数,含杂散光校正,寿命分布曲线,各向异性分析,全局分析,严密错误分析等功能。

FluoPlot软件包括许多有用的功能和可视化工具,例如

  • 三维可视化的衰减测量,并带有自由三维旋转功能,可调整的色标,不同的投影样式和各种导出功能
  • 2D可视化衰减曲线测量
  • 通过3D可视化切割出可调整的2D数据
  • 发射光谱与衰减时间的关系
  • 荧光衰减与发射波长的关系
  • TRES测量时间间隔分析:结合多个时间或波长通道以获得更高的统计量;定义和显示多个间隔
  • 波长数据的光谱校正
  • 将所有数据导出为ASCII

可选配件

色散相减双单色仪



配备MCP-PMT检测器和超快激发源的FluoTime200系统可以选择配置这种色散相减双单色仪(ScienceTech 9030DS),其中两个光栅色散模式以减法工作。第一单色仪选择带通,第二单色仪然后去除时间和角度像差(色散)。结果表明,该方法具有较好的杂散光抑制效果和最终提高时间分辨率。

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NIR-PMT检测器


该类特殊的光电倍增管适用于NIR波段的单光子信号探测。H10330-45 采用 InGaAsP 光阴极,波长范围涵盖从 950 nm 到 1400 nm。H10330-75 型具有 InGaAs 光阴极,其波长探测范围可延伸至 1700 nm。该模块具有抽成高真空状态的热绝缘密封外壳,无需液氮、真空泵或水进行冷却。

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MCP-PMT检测器



该类型探测器是现如今速度最快的光子计数探测器。根据各种光阴极材料不同其可探测波长范围从 160 nm 至 910 nm可选。使用此探测器并配合钛蓝宝石激光作为激发源,在 FluoTime 200系统上 实现了 32 ps 的仪器响应函数(IRF)。该模块具有专用的高压电源,并可安装于带热电冷却的外壳中,此时,水冷也是必要的。

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NIR-PMT检测器

氙气闪光灯


氙气闪光灯以高达300 Hz的重复频率发射脉冲宽度约400 ns的闪光,非常适合研究缓慢的光致发光衰减过程,例如磷光或镧系元素的发射。专用的ScienceTech 9030单色仪用于从氙气宽发射光谱中选择所需的激发波长。该灯仅需12V电源和一个外部触发信号。后者可以通过例如TimeHarp 260 NANO多路测量采集卡提供,该TCSPC采集卡通常与闪光灯一起使用。

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液氮低温恒温器


FT200仓室足够容纳牛津仪器 OptistatDN 系列低温恒温器。此组件可以进行样品在低温环境下的光致发光测量,通过选择不同型号的低温恒温器,可以在温度范围从2.3 K 到 500 K范围内对样品的温度进行精确的控制,该类恒温器包括一个单独的数字温度控制器。

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NIR-PMT检测器

格兰-泰勒偏振器


格兰-泰勒偏振器可以选择配备并安装在发射臂和激发臂中。这种偏振器在250 nm-2700 nm光谱范围具有非常高的对比度。安装座上清楚标出了水平,垂直和魔角位置。可以随时轻松完成偏振片的安装和拆卸。

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NIR-PMT检测器

样品架


FluoTime 200可以配备一个比色皿架和一个正面固体样品架。标准比色皿架为放置1 cm×1 cm的比色皿所设计,还为水循环系统做好了进水口。对于一些固体薄膜类样品,可以安装正面样品架以研究固体样品。如果有特殊要求,也可以使用其他类型的样品架。

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NIR-PMT检测器

帕耳帖冷却样品架

FluoTime 200可以配备珀耳帖冷却的比色皿支架,并带有来自Quantum Northwest的集成磁力搅拌器。支架为放置1 cm×1 cm比色皿所设计。温度可以使用外部控制单元在大约 -50°C到100°C之间进行设定,也可以通过专用软件和USB接口进行编程控制。

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NIR-PMT检测器

快速动力学(停流技术)配件


TgK Scientific Ltd.的快速动力学附件(SFA-20系列)使监视溶液中的快速反应(以毫秒为单位)成为可能,例如酶动力学,猝灭,缔合/解离等。该附件的deadtime<8 ms ,可选配小体积版本,气动驱动,厌氧套件,可变比例混合,多混合版本和高级分析软件(Kinetic Studio)。

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NIR-PMT检测器

多通道单元


对于发射强度非常低的样品,FluoTime 200可以配备一个多通道单元,有效增加样品被激发的体积,从而增加信号强度。比色皿支架旁边的两个反射镜用于将激发光束反射多次穿过样品。这些多重激发将导致整体仪器响应函数的展宽,这意味着该多通道单元最适合长寿命衰减(磷光)的测量。

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NIR-PMT检测器

FluoPlot

在时间分辨荧光研究中,在溶剂弛豫动力学和一般光谱演化的背景下,观察随时间变化的光谱位移和衰减变化是很有意义的。这就需要记录时间分辨发射光谱(TRES),理想情况下是在完全软件控制下通过自动波长扫描和TCSPC数据收集来完成。

为了测量结合荧光寿命的发射光谱,FluoTime 200数据采集软件提供了自动TRES测量模式。该模式通过步进电机控制单色仪,并自动收集光谱相关的寿命直方图来完成测量。

为了对这些测量数据进行分析,该系统还提供了Fluoplot软件。它为支持您的分析,插图和文档编制工作所设计,并提供许多有用的图形和数据导入和导出工具。而且该软件还包含配合荧光衰减分析包FluoFit使用的接口。直观的导航和鼠标或键盘的便捷控制,使您在短时间操作之后就可以瞬间熟悉该操作。

FluoPlot软件包括许多有用的功能和可视化工具,例如

• 三维可视化的衰减测量,并带有自由三维旋转功能,可调整的色标,不同的投影样式和各种导出功能

• 2D可视化衰减曲线测量

• 通过3D可视化切割出可调整的2D数据

• 发射光谱与衰减时间的关系

• 荧光衰减与发射波长的关系

• TRES测量时间间隔分析:结合多个时间或波长通道以获得更高的统计量;定义和显示多个间隔

• 波长数据的光谱校正

• 将所有数据导出为ASCII


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应用例子

L-色氨酸水溶液



用300 nm激发L-色氨酸水溶液(HPLC质量),将单色仪设置在350 nm,带宽为4 nm处进行信号收集,在50秒的测量时间内收集了150万个计数,所测量的仪器响应函数(IRF)为600 ps(FWHM),在该装置中未使用偏振器。


和预期的一样,衰减最好用三重指数衰减函数来描述。图片显示了测得的IRF(红色)、衰减(蓝色)以及拟合结果(黑色)。三阶的寿命为0.35±0.18 ns,2.65±0.1 ns和7,93±0.1 ns,误差分析在相应的功能界面进行。


测量装置:

• FluoTime 200

• 激发光源:PLS 300,10 MHz重复频率

• 分析软件:FluoFit

注:FluoFit已停产,相应的分析功能请使用EasyTau2

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NATA水溶液


用280 nm激发10 µM NATA(N-乙酰基-L-色氨酸酰胺)水溶液,将单色仪设置在350nm(16 nm带宽)处检测荧光发射。在60秒内收集了130万个计数,相应的平均探测计数率21.7 kHz,即小于激发率的1%,从而避免了脉冲堆积效应(pile-up)。测得的仪器响应函数(IRF)为700 ps(FWHM)。图片显示了IRF(红色),衰减(蓝色)和拟合的单指数曲线(黑色)。拟合寿命为2.88 ns,卡方值1.065,拟合结果的质量还可以通过底部的残差分布来判断。

测量装置:

• FluoTime 200

• 激发光源:PLS 280、2.5 MHz重复频率

• 分析软件:FluoFit

注:FluoFit已停产,相应的分析功能请使用EasyTau2

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缓冲液中的apomyoglobin蛋白


Apomyoglobin蛋白全长具有154个氨基酸,包括两个色氨酸和三个酪氨酸。在280 nm处激发该蛋白在乙酸盐缓冲液中形成的5 µM溶液。格兰泰勒偏振器,用于选择激发光的垂直偏振分量和荧光的魔角偏振分量。将单色仪设置在350 nm,带宽30 nm处对发射信号进行收集,在4分钟的测量时间内收集了120万个计数,仪器响应函数(IRF)为700 ps(FWHM)。对测量结果的分析表明,最好用三阶指数衰减函数来描述该衰减过程,图片显示了IRF(红色),衰减(蓝色)和拟合的三指数曲线(黑色)及强度分布。

可以通过快速各向异性衰减分析获得有关蛋白质动力学的更多信息。收集了另外两个直方图数据,即所谓的平行和垂直偏振衰减。最简单的各向异性分析根据那些偏振衰减直接计算各向异性衰减曲线R(t)。在独立水平偏振激发衰减测量中确定了必要的G因子。图片显示了在前20 ns内各向异性(蓝色)的时间演变以及拟合的单指数衰减曲线(黑色)。时间分辨的各向异性显示出平均旋转相关时间为1.6 ns,残余各向异性为0.05。这种残留的各向异性清楚地表明,这是一个较慢的过程,不能用酪氨酸和色氨酸的荧光作为指示剂来解决。事实上,无球蛋白的期望转动相关时间在7-8纳秒左右,这一过程极有可能是残留各向异性的原因。

测量装置:

• FluoTime 200

• 激发光源:PLS 280、2.5 MHz重复频率

• 分析软件:FluoFit

注:FluoFit已停产,相应的分析功能请使用EasyTau2